С днeвнoй oтмeткoй, пoстрoeнный нa oснoвe рeгулирoвaния oблaсти гeнa crestin рыбoк дaниo-рeриo, группa учeныx из сшa, Швeйцaрии и Гeрмaнии прoслeдилa пeрвыe стaдии зaрoждeния и рaзвития мeлaнoмы. Из мнoжeствa клeтoк, кoтoрыe нeсут нa oнкoгeнныe мутaции, нeкoтoрыe тoлькo мoгут дaть нaчaлo рaкoвoй oпуxoли. Тaким oбрaзoм, гeнoмы мeлaнoцитoв мнoгиx дoбрoкaчeствeнныx рoдинoк или бoрoдaвoк (нeвусoв) имeют oнкoгeнную мутaцию BRAFV600E, нo эти рoдинки oчeнь рeдкo прeврaщaются в мeлaнoму. Oкaзaлoсь, чтo при вoзникнoвeнии злoкaчeствeннoй oпуxoли oтдeльныx мeлaнoцитoв пeрeпрoгрaммируются в сoстoянии свoиx пeрвыx эмбриoнaльныx прeдшeствeнникoв. Удaлoсь тaкжe выявить фaктoры трaнскрипции и aдaптaции xрoмaтинa, связaнныe с трaнсфoрмaциeй прeдрaспoлoжeны к рaку клeтoк дoбрoкaчeствeнныx в злoкaчeствeнныe.
Генетический аппарат клеток обладает сложной системой регуляции деления, роста, дифференцировки и физиологической смерти клеток. Нормальное протекание этих процессов, в том числе предотвращения неконтролируемого роста клеток и образование раковых опухолей, регулируется в основном двумя типами генов с противоположным набором функций — протоонкогенами, стимулируя рост клеток, и антионкогенами (генами-супрессорами опухоли), сердечно-чрезмерный рост (более онкогенах и антионкогенах см. в новости На пути к детальному каталогу раковых генов, «Элементы», 06.04.2015). Известно, что причиной возникновения раковых клеток и опухолей в целом и меланомы в частности, являются мутации, активирующие протоонкогены и/или инактивирующие генов-супрессоров опухолей. Эти ключевые события онкогенеза (см. генетические аспекты канцерогенеза) уже достаточно хорошо изучены. Но, в процессе онкогенеза происходят и другие события молекулярных механизмов, участвующих, перепрограммирующие нормальных клеток в раковые. Они остаются еще мало исследованными.
Меланома это очень агрессивный рак — образуется в результате злокачественной трансформации меланоцитов, клеток кожи, продуцирующих пигмент меланин. Для изучения первых событий, которые происходят во время формирования меланомы, авторы обсуждаемой работы провели эксперименты на рыбках данио-рерио (Danio rerio). Эти рыбки, вместе с мышами любимая модель объекта исследования эмбриологии и молекулярной биологии позвоночных.
В лаборатории ранее были получены трансгенные несущие мутант активированный протоонкоген человека BRAFV600E, которая часто обнаруживается в опухоли у больных меланомой. Выражение протеина BRAFV600E контролируемую промоутер mitfa, который работает только в меланоцитах. Если в геном рыбы, также отсутствовал активный антионкоген p53 (подробнее об этом см. в новости На пути к детальному каталогу раковых генов, «Элементы», 06.04.2015), на ее теле появились пятна и бородавки (родинки), и после нескольких месяцев превратилась в меланому. Но, несмотря на наличие многочисленных невусов, меланома развивается только в некоторых из этих «ракоопасных» этапы. Таким образом, авторы предположили, что для формирования меланомы играют важную роль еще какой-то молекулярные события, и вышли на их изучение.
Ранее, с помощью гибридизации in situ было показано , что меланома снова начинает экспрессироваться плода ген рыбок данио-рерио crestin, что зрелому организму не свойственно. Функция этого гена и его изделия до сих пор неизвестны, но известно, что в процессе эмбриогенеза ваш продукт маркирует клетки, предшественники нервного гребня (нервный гребень предков, NCP), из которого развиваются меланоциты, и исчезают через 72 часа после оплодотворения. Эти данные побудили исследователей строить ген-репортер на основе регулирования элементов гена crestin и использовать его для изучения первых этапов формирования меланомы. Они выделили регуляторных элементов гена как часть большой фрагмент ДНК (4,5 тыс. пар нуклеотидов, п. н.), соединили его с ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (enhanced green fluorescent protein, EGFP) и ввели эту конструкцию в геном данио с помощью методов генной инженерии (fig. 2).
Рис. 2. Локус crestin и конструирована на основании его положений элементов дневные журналистам. В верхней части — локус crestin (прототип). Показано расположение LTRэта последовательность нуклеотидов, U3-промотороподобной согласованности и последовательности гена crestin, кодирующей белок. ORF (Open reading frame) — открытая рамка считывания, LTR (Long terminal repeat) — длинный концевой повтор. Ниже — пикселей в длину и 4,5 тыс. п. н. и 1 тыс. п. н. используются для строительства журналистам — рекомбинантный промоторы гена crestin:EGFP. Белый фрагмент стрелка — минимальный промотор гена β-глобина (см. Бета-globin). Изображения из обсуждения статьи в Science
Было показано, что экспрессия EGFP от этого искусственного элемента точно воспроизводит экспрессию гена crestin в только самки данио-рерио, и, в частности, бренд стволовые клетки и клетки предшественники в формировании нервном гребне зародыша и меланоцитов. Введение такого репортера позволило визуально зафиксировать данио генезис и развитие меланомы (данио-рерио в ранних стадиях развития, полностью прозрачны для видимого света, и это делает их удобной моделью организма для исследования с использования меток, люминесцентных). Можно было наблюдать изолированные флуоресцирующие клетки задолго до формирования из них морфологически представляют опухоли (fig. 1). При трансплантации чешуя с таких изолированных флуоресцирующими клеток в других областях тела данио из них развивалась меланома, прораставшие в гиподерму (первый слой кожи). Таким образом, отдельные клетки уже были инициаторы опухолей.
Рекомбинантный репортер (промотор гена crestin:EGFP) позволило исследовать молекулярные механизмы превращения потенциально онкогенных злокачественных клеток. Во-первых, авторы выделили минимальный фрагмент ДНК, имеющий все элементы, регуляторы гена crestin из клонированных ранее, стрейч, длина, 4,5 тыс. п. н. Устраняя избыток, он удалось снизить сначала до 1 тыс. п. н. (fig. 1), а затем, 296 п. н. (fig. 3). Биоинформатический анализ структуры этой фазы длина 296 п. н. я обнаружил в нем последовательности нуклеотидов, что в области связывания (Binding site) факторов транскрипции. Эти выдержки из ген-репортер вводили инактивирующие мутации и наблюдали экспрессии EGFP под контролем мутантов этапы во время развития эмбриона данио.
Ряд экспериментов позволил установить степень важности различных сайтов связывания и, соответственно, транскрипционных факторов, которые регулируют выражение гена crestin в эмбриогенезе. Таким образом, дефект один сайт связывания, pax3 на экспрессию генов crestin практически не повлияла, и недостатки, веб-сайтов, sox10, tfap2 и И-box — сильно подавлена (fig. 3). Эти результаты предполагают, что выражение репортер регулируется факторами транскрипции, своеобразный отдел развития гребня.
Рис. 3. Мутации в областях распознавания факторов регуляции транскрипции, sox10, tfap2 и E-box/myc (mitf), связанные с эмбриогенезом отдела, гребешки, значительно снижает уровень конкретного выражения репортера (промотор гена crestin:EGFP), длина-296 п. н. в эмбрионах 24 часа после оплодотворения. Мутации в гипотетической сайт pax3 она почти не влияет. В экспериментах по трансплантации, был использован на 80% или более эмбрионов. Кооператив инъекции с репортером, ubi:mCh было, как управление трансплантации. Справа показывает, какая доля эмбрионов с указанным типом выражения репортер crestin:EGFP длина 296 п. н. Ectopic — неспецифическая выражение. Neural Crest — конкретные выражения в нервном гребешке. NC+ect — смешанные выражения. Изображения из обсуждения статьи в Science
Анализ спектра и уровня экспрессии большого набора генов в EGFP+-области с помощью гибридизации на чипах, с подтверждением количественной ПЦР с обратной транскрипцией показал, что, когда на заре меланомы возрождения молекулярные события, и профиль экспрессии генов, характерных для предшественников нервного гребня (NCP). Искусственного усиления экспрессии гена sox10 в меланоцитах экспериментальных данио резко ускоряло возникновение и развитие меланомы, и его подавление, что замедляло эти процессы.
Была также изучена в регуляции экспрессии генов нервном гребне зародыша на эпигенетическом уровне (то есть, вызванных механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК; в этом случае, изменения хроматина) и сопоставлена с такой родниковой меланомы. Участки хроматина с высоким содержанием гистона H3 (Гистона H3), ацетилированного позицию K27 (H3K27Ac) (см. модификации гистонов, Modifications to гистонам), известны как суперэнхансеры (Super-enhancer, ЕСЛИ). Они общаются с основные факторы транскрипции, которые регулируют экспрессию генов, специфических для данного типа клеток или раковых клеток.
Для характеристики суперэнхансеров применили метод иммунопреципитации фрагментов хроматина с антителами для Н3К27Ас и с последующим качественным и количественным определением нуклеотидной посдедовательности ДНК в преципитированных фрагменты. Для анализа профиля генов, открытых для большего выражения, применяется метод АТАКИ-последовательности (ATAC-seq). Результаты, полученные с помощью обоих подходов, показали сходство набора активно экспрессирующихся генов на ранних стадиях развития меланомы и образование гребня (fig. 4).
Рис. 4. Модель запуска меланомы, в результате «возвращения», меланоциты в состояние, предшественники нервного гребня (NCP), и, как следствие, активации супер-энхансеров (Super-enhancer, ЕСЛИ). В нормальной ткани происходят генетические события, которые приводят к активации онкогенов (BRAFV600E) и инактивации супрессоров опухолей (р53–/–). В результате преодолевается «барьер нормальности» и возникать «ракоопасные области». В этих областях, отдельные ячейки преодолеть еще один барьер — возвращаются в состояние, предшественники нервного гребня (NCP) и приступаем к формированию меланомы. Подавление процесса возвращения медикаментозными или другими средствами может заблокировать начало меланомы. Изображения из обсуждения статьи в Science
Таким образом, показано, что, помимо мутаций протоонкогенов и антионкогенов, важным событием для начала меланома-это возвращение клеток-меланоцитов в его зачаточном состоянии предшественники (fig. 5).
Рис. 5. Перепрограммирование меланоцитов приводит к злокачественной трансформации клеток. В процессе эмбрионального развития рыбы данио в предшественников нервного гребня (NCP), возникает выражение гена crestin (выделено зеленым), которая регулируется специальным набором факторов транскрипции. А затем, NCP мигрируют и превращаются в меланоциты (серый), что выражение гена crestin прерывается. В модели данио BRAFV600E/p53–/–-меланоциты экспрессируют онкоген, но только некоторые из них начинают экспрессировать crestin и дают начало инвазивной меланомы. Это происходит в результате случайного обратного перепрограммирования, в ходе которого, из-за активации суперэнхансеров ряд ключевых генов эмбриогенеза меланоциты, несущие онкогены, «возвращенцы» в состояние, похожее на NCP. Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Science
Может быть, эти события происходят во время развития многих видов рака. Это описано перепрограммирования, в принципе, открывает новые возможности для диагностики рака и для поиска новых мишеней противораковой терапии — с целью заблокировать этот процесс. Но ряд важных вопросов остается нерешенным. Например, какое значение для инициации опухоли имеет формирование специфического микроокружения («нишу») и как это происходит? Также важно, с описанной флуоресцентный маркер проследить, как меланома превращается в инвазивную опухоль, что факторы транскрипции, эпигенетические регуляторы и сигнальные пути могут быть необходимы для инициации и прогрессии опухоли. Следует также отметить, что аналоги гена crestin данио-рерио, ни мышей, ни муж еще не были найдены. Обнаружение таких маркеров эмбриогенеза позволит детально изучить на начальных стадиях образования опухоли в организме человека.
Источники:
1) Charles K. Kaufman, Кристиан Mosimann, Zi Peng, Fan, Сонг Янг, Эндрю Дж. Томас, Жюльен Ablain, Джастин L. Tan, Рэйчел D. Fogley, Ellen van Rooijen, Elliott J. Hagedorn, Кристи Ciarlo, Richard M. White, Доминик A. Matos, Ann-Christin Puller, Кристина Santoriello, Эрик C. Liao, Ричард A. Янг, Леонард I. Zon. В zebrafish меланомы model открывает большие emergence of neural crest identity течение меланомы initiation // Science. 2016. DOI: 10.1126/science.aad2197.
2) Soufiane Boumahdi, Седрик Blanpain. Tracking the origins of опухолей // Science. 2016. Ст. 51. P. 453-454. (Популярный синопсис к обсуждаемой статье в Science.)
Вячеслав Калинин
