Ученые выяснили, почему бактериофагам трудно иметь дело с иммунной системой бактерий

В старой системы приобретенного иммунитета CRISPR-Cas, широко распространенный в прокариот, защищает своих носителей от вирусов. Тем не менее, вирус, постоянно мутируя, способны быстро (иногда менее, чем за день) преодолеть невосприимчивость определенной жертвой. Как оказалось, эффективность системы CRISPR обеспечивается тем, что благодаря ее работе различных бактерий учатся распознавать вирус в разные части вашего генома. В результате способы защиты бактерий от этого вируса становятся настолько разнообразными, что никакие точечные мутации уже не помогают, что вирус эффективно адаптироваться к коллективной обороны жертв. Это, в свою очередь, вносит свой вклад в развитие специальных вирусных генов, подавляющих функционирование системы CRISPR в целом, бактерии отвечают за это развитие новых возможностей системы CRISPR— но такие изменения требуют больше времени.

Работа системы CRISPR-Cas основан на том, что небольшой фрагмент, вырезанный из проникшей в бактериальную клетку чужеродной (например, вируса) ДНК вставляется в участок (локус CRISPR) генома бактерий. Каждый локус CRISPR содержит набор таких вставок («спейсеров»), которые представляют собой куски генетического материала паразитов (вирусы, плазмиды, элементы мебели). На основе спейсеров синтезируются молекулы РНК, комплементарные участка генома паразита. Эти РНК в комплексе с белками Cas используются для идентификации и очистки ДНК пришельцев, с такой же последовательностью нуклеотидов. Таким образом, если клетка однажды проникла вирусная ДНК, но мобильный телефон, ухитрилась выжить, включил часть вирусного генома в его хромосомы, последующие попытки же вирус, чтобы заразить квадрат или его потомки будут обработаны быстро и эффективно (более подробный рассказ о системе CRISPR, читатель найдет ссылки, представленные в конце новости).

Тем не менее, вирус как правило не долго «так». Путем случайных мутаций и отбора, они могут обходить иммунную защиту жертв. Для этого спейсер утратил свою эффективность, достаточно дополнить его фрагмента вирусного генома, по крайней мере, мало что изменилось. Таким образом, вирус успешно и, иногда, очень быстро отжимают, приобретенный иммунитет бактерий через точки мутации. С другой стороны, система CRISPR являются очень распространенными (и, по-видимому, гарантируют своим обладателям защиты. Что позволяет использовать эти системы на равных конкурировать с быстро развивается, паразитов?

Генетики и микробиологи Великобритании, Франции и США предположили, что существенный вклад в эффективность CRISPR способствует тот факт, что, в ответ на одну вирусную инфекцию, даже генетически идентичные бактериальные клетки вставлены в геном различных спейсеры, соответствующих различным областям генома вируса. В результате население жертв быстро приобретает генетического разнообразия, что значительно увеличивает ходьбы, до вирусов эволюционную задачу. Приобретение точечной мутации, которая защищает прокладку, вирусы могут заразить, только небольшая часть населения, жертв. К счастью для бактерий, бактериофаг не может определить заранее, какие спейсеры есть проблема-клеток: это станет ясно только тогда, когда он впрыснет в вашу ДНК, и тогда уже будет поздно передумывать. Таким образом, большинство бактериофагов в полиморфной популяции жертв приговорен к смерти, даже если вы бактериофаги время от времени появляются точечные мутации, защищают прокладку. Чтобы защитить себя сразу от многих различных спейсеров, фагу, в то же время, получить структуры, необходимые точки мутации, что это крайне маловероятно, потому что мутации являются случайными.

Проверка этих предположений была проведена бактерий синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa) и фагах DMS3vir. Для начала, авторы убедились, что система CRISPR действительно защищает бактерии от различных фагов. В популяции «диких» бактерий, сделанные исследователями фаги полностью вымерли в течение 5 дней. В культурах бактерий с плохой системой CRISPR вирусов чувствовать себя вольготнее: 30 дней, пока длился опыт, вирусов не вымерли или в одной из линий. В первом случае, все бактерии, как и следовало ожидать, начали наследует приобретенного иммунитета на основе CRISPR. Бактерии отключена система CRISPR также разработали какой-то защиты, но по-другому: они распространились мутации, изменяют поверхность протеина приемник, который цепляется фаг, чтобы заразить клетку. Казалось бы, второй способ был менее эффективным и не позволил, что население полностью избавиться от паразитов, как сделал население под управлением системы CRISPR.

Авторы подчеркивают, что полного исчезновения вируса в популяции дикого типа-это неожиданный результат, поскольку известно, что вирус, который, в принципе, могут отслеживать CRISPR-иммунитет с помощью точки мутации. Может быть, все дело в разнообразии, спейсеров, формируется бактерий внутри каждой из экспериментальных популяций? Что спейсеры действительно получаются разные, как было показано в предыдущих экспериментах. Теперь нужно было доказать, что это разнообразие способствует повышению эффективности коллективной обороны хозяина. Для этого необходимо сравнить устойчивость к вирусу у населения с различными уровнями разнообразия спейсеров.

Для получения популяций, авторы имели их экспериментальной линии победителей вирус с помощью CRISPR, и выделили из них 48 индивидуальных клонов (то есть, взяли 48 отдельные клетки каждого многочисленное потомство). Ученые надеялись (и эти ожидания впоследствии подтвердили), что спейсеры все или почти все клоны будут разными. Затем из этих клонов были составлены населения пять различных типов уровень генетического разнообразия: население из одного клона (монокультуры) и смешанные популяции, состоящие из 6, 12, 24 и 48 клонов.

Эти запасы, а затем подвергаются воздействию вирусной инфекции. На этот раз ученых интересовало в первую очередь, развитие вируса, то есть его способность преодолевать иммунную защиту жертв. Таким образом, наблюдения длилась всего 3 дня — достаточно времени для заметных эволюционных изменений, с вирусами, но недостаточно для экспериментальной популяции бактерий есть время, создавая новые спейсеры, для того чтобы выровнять уровень генетического разнообразия.

Результаты подтвердили ожидания своих авторов. В течение трех дней вирус полностью вымерли на всех популяций жертв, составленные начиная с 24 и 48 клонов, и во многих популяциях, составленных из 12 клонов. По крайней мере, различных групп населения, состоящих или шесть клонов, вирусы, в большинстве случаев, были пощажены.

Каждые несколько часов в течение этих трех дней эксперимента большинство вирусов изымалась для детального анализа. Бактериофаг представлен к полногеномному секвенированию, а также развертывание их в чистые культуры каждого из 48 клонов бактерий, чтобы увидеть, в некоторых случаях вирус научились преодолевать иммунную защиту жертв.

Оказалось, что вирус, который три дня, превратилась в монокультурах бактерий, в большинстве случаев, были зафиксированы мутации, делающие соответствующий спейсер неэффективным. И произошло это, как правило, уже в первый день. Только пять из 48 монокультур вирусом справиться не могут. Как выяснилось, в трех случаях из пяти, бактерии не закончил, по одному, по два или более противовирусных спейсеров.

Вирусы, которые развивались в популяциях бактериальных, состоящие из 6 и 12 клонов, сопротивление в той или иной форме спейсерам сформирован только в нескольких случаях. Но те бедолаги, которые должны были развиваться в самых разных популяций жертв, составленные начиная с 24 и 48 клонов, не научились преодолевать защиту, ни один из клонов (fig. 2).

Рис. 2. Генетическое разнообразие жертв предотвращает вирусов преодолеть их иммунной защиты. На рис. показаны результаты экспериментов, вирусной инфекции, коэволюционировавшими с различных популяциях бактерий, каждая из 48 бактериальной клонов. Каждый из пяти столбцов соответствует ряд экспериментов с одним из пяти уровней, разнообразие жертв (слева направо: 1 клон, 6, 12, 24, 48 клонов). В каждом эксперименте вирусов для анализа брали после 0, 16, 24, 40, 48, 64 и 72 часа после заражения (6 вертикальных рядов, в каждом столбце, ниже подписано время на место после инфекции — d. p.i.). Каждой порции, полученных таким образом вирус был чистый и культуру каждой из 48 клонов бактерий и посмотрел, будет ли вирус распространяться (красные квадраты) или исчезнувших (зеленые квадратики). Толстые горизонтальные черные полосы, отдельные повторности, существуют различные экспериментальные населения с таким уровнем разнообразия. Рис. показывает, что в монокультурах бактерии, вирусы, в большинстве случаев, менее чем на день, они научились преодолевать иммунную систему обороны, в популяциях, 6 и 12 клонов, это случалось редко, в популяциях, 24 и 48 клонов — никогда. Изображения из обсуждения статьи в Nature

Причина, конечно, не в том, что этих вирусов «правильные» мутации возникли с низкой частотой. Мутагенез, вероятно, прошла так же как и все вирусы. Только в монокультуре отдельных мутаций, что обеспечивает защиту от этой прокладки, сразу дает вирус огромное преимущество, поскольку позволяет заразить любого типа бактерии), и в полиморфной культуры от 48 клонов точно так же мутация обеспечит вирусу-мутанту успеха только с вероятностью, 1/48. Даже если он нашел, повезло, и он впрыснет свой ДНК-это вид бактерий, кто прокладку, теперь он защищен, его потомки снова столкнутся с той же проблемой. И она будет только ухудшаться по мере уменьшения количества бактерий клон, что стала уязвимой. Тем не менее, как правило, даже не являются: выбора практически нет вирусов точечные мутации, защищают человека спейсеров, и вирусы умирают, так и не смог преодолеть защиту, ни один из 48 клонов.

Эти выводы подтверждаются тем, что число мутаций, обнаруженных в геноме вирусов, эволюционировавших в монокультурах жертв, был значительно выше, чем у вирусов, эволюционировавших смешанных посевов: в первом случае, выбор сохранил с вирусами полезные мутации, а во втором нет. Кроме того, оказалось, что бактерии из смешанных культур в течение трех дней, не приобрела новых противовирусных спейсеров, в то время как в монокультурах, таких спейсеры появился. Это также очевидно: в смешанных культурах опасные бактерии, вирусы и не появился, и в монокультурах появились вирусы, пробивающие старой защиты и системы CRISPR создал более спейсеры.

Таким образом, разнообразие спейсеров, созданный на системе CRISPR, действительно вносит важный вклад в ее эффективность. Если на все инфекции инициатор создания же прокладка все бактерии, вирусы легко сможет иммунитета. А потому, что спейсеры каждый раз получаются разные, точки мутации и выбор делают-вирус не является достаточно эффективной эволюционной стратегии.

Это объясняет эффективность системы CRISPR и его широкого распространения прокариот. Осталось понять, почему мутации еще не вымерли, раз система так хорошо. Ответ на этот вопрос, в частности, уже известно: в последнее время я фаг были найдены специальные гены, подавляющие системы CRISPR как таковой (см.: Дж. Бонда-Denomy et al., 2013. Bacteriophage генов that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system). В этом контексте возникает следующий вопрос: если существуют вирусных генов, полностью выводящие сбой CRISPR, на все вирусы, что не имеет? Бактерии могут гены бороться? Тем не менее, ответ на этот вопрос также уже частично известно: существует множество различных вариантов систем CRISPR, каждый из которых уязвим только для некоторых вариантов генов анти-CRISPR и защищен от других. И содержать в своем геноме много дополнительных генов — дорогой вирус, что выбор, как правило, поддерживает компактизацию генома (увеличение скорости размножения вируса).

По-видимому, антагонистическая коэволюция (гонки вооружений) между фагами и бактериями идет параллельно на разных уровнях и в разных масштабах времени. Формирование новых спейсеров и производство вирусов точки мутации, которые уверовали спейсер неэффективным, занимает всего несколько дней, или даже часов. Производство новых генов анти-CRISPR или новые варианты системы CRISPR, неуязвимых для этих генов, возможно, требует, чтобы тысячи и миллионы лет (хотя в мире вирусов и микробов всего, что было, когда кто-то что-то придумал, может быть быстро передается из рук в руки, через горизонтальный перенос). В конце гонки не ожидается, и вряд ли кто-то будет «победитель». Тем не менее, знание ее механизмов позволяют людям в будущем, по крайней мере, взять ее под свой контроль.

Источник: Stineke van Houte, Alice K. E. Ekroth, Дженни M. Broniewski, Hélène Chabas, Бен Эшби, Джозеф Бонди-Denomy, Сильвен Gandon, Майк Boots, Стив Патерсон, Ангус Гнуть & Edze R. Westra. The diversity-generating benefits of prokaryotic adaptive immune system // Nature. 2016. DOI: 10.1038/nature17436.

См. также о системе CRISPR:

1) Бактерии наследуют приобретенный иммунитет, «Элементы», 21.01.2010.

2) Приобретенный иммунитет бактерий может быть связано с механизмами РНК-интерференции, «Элементы», 6.04.2011.

3) Прокариотическая система иммунитета поможет редактировать геном, «Элементы», 12.03.2013.

О коэволюции паразитов и хозяев:

1) С паразитами не обязательно бороться, они могут адаптироваться, «Элементы», 7.11.2007.

2) паразиты опаснее прошлых и будущих, «Элементы», 12.12.2007.

3) Муравьи стараются не пахнуть как гусеницы, пахнущие как муравьи, «Элементы», 10.01.2008.

4) Амебы-мутанты не позволяют себя обманывать, «Элементы», 6.10.2009.

5) Коловратки спасаются от паразитов, летать на другие водоемы, «Элементы», 2.02.2010.

6) Гонка вооружений — двигатель эволюции», «Элементы», 1.03.2010.

7) Бактериальная инфекция, которая приводит к необратимой потере полового размножения, «Элементы», 9.09.2010.

8) Разнообразие тропических насекомых поддерживается благодаря узкой специализации паразитов», «Элементы», 18.03.2014.

9) другая стратегия защиты приводит к разному эволюционному отклику, «Элементы», 10.06.2015.

Александр Марков

Комментирование и размещение ссылок запрещено.

Комментарии закрыты.