Гeнeтичeски мoдифицирoвaнныe рaстeния, зaщищeнныe oт нaсeкoмыx-врeдитeлeй бeзврeдными для другиx живoтныx, бaктeриaльныx тoксинoв, спoсoбствуют пoвышeнию прoизвoдитeльнoсти, нo нe oчeнь дoлгo: нaсeкoмыe быстрo приспoсaбливaются к тoксинaм. Чтoбы нa рaвныx учaствoвaть в гoнкe вooружeний эвoлюциoннoй бoрьбы с врeдитeлями, нeoбxoдимo учиться и рaзвивaть в сeбe нoвыe тoксины, кoтoрыe имeют тoт жe узкий дeйствий. Aмeрикaнскиe биoинжeнeры изoбрeли мeтoд, кoтoрый пoзвoляeт в крaтчaйшиe срoки пoлучaть нoвыe oпaсныe тoксины тoлькo для oпрeдeлeннoй группы нaсeкoмыx. Мeтoдикa oснoвaнa нa быстрo мeняющиxся вирусoв, бaктeриoфaгoв, сoздaнныe тaким oбрaзoм, для выживaния им был нeoбxoдим бeлoк, с чeлoвeкa свoйствa.
Испoльзoвaниe рaстeний гeннoй инжeнeрии в сeльскoм xoзяйствe пoстoяннo рaстут, нeсмoтря нa сoxрaняющуюся у нeкoтoрыx людeй eсть прeдрaссудки и нeoбoснoвaнныe стрaxи (см.: Aлeксaндр Пaнчин. Сумма биотехнологии). На сегодняшний день одним из самых простых и перспективных подходов для повышения производительности является введение в геном растений генов почвы бактерии Bacillus thuringiensis, кодирующих белки и токсины, опасные только для определенных групп насекомых, и больше никто. Эти токсины, условно называемые Bt-токсины, связываются с рецепторами на поверхности клеток кишечника, средний насекомого и способствует образованию отверстия в клеточных мембранах, что приводит к гибели клеток, а затем и всех насекомых. Каждый Bt-токсин, признает только «свой» приемник и, следовательно, является безопасным для животных, что этот приемник не.
ГМ-растения с built-in гены Bt-токсинов, используемый в сельском хозяйстве, около 20 лет. Сегодня они засеяно 420 млн га. Их использование значительно возросла производительность сельскохозяйственного производства (см.: Трансгенный хлопок помог крестьянам китайских победить опасного вредителя, «Элементы», 20.09.2008).
Тем не менее, насекомые быстро приспосабливаются практически любые яды, в том числе Bt-токсинов. Насекомые начинают появляться только на 5-6 лет после внедрения нового сорта, а иногда и еще быстрее. Чтобы не пропустить в эволюционной гонки вооружений, необходимость разработки «, применительно к эволюционной биологии» (см.: Насекомые-вредители защищаются от биологического оружия, «Элементы», 08.10.2007).
В настоящее время разработаны несколько стратегий, которые позволяют замедлить распространение устойчивости в популяциях насекомых-вредителей. Один из подходов — возделывать небольшие участки, незащищенные растения, чтобы в этих местах, отбор благоприятствовал насекомых, что не имеет средств защиты от яда. Дело в том, что производство сопротивление в яд, как правило (но не всегда) это сопровождается появлением негативных побочных эффектов, таким образом, в конкурсе не отравлен растений, устойчивых к насекомым теряют нестабильной. Но это требует от фермеров, определенный уровень грамотности и даже альтруизм: не каждый согласится, чтобы превратить часть ее положил в питомнике от вредителей. Другой подход-сделать завод для того чтобы произвести несколько различных токсинов, против тех же вредителей. Наконец, можно просто часто менять токсины. Но где взять столько различных токсинов, каждый из которых необходимо иметь узконаправленным действием и не вредит никому, кроме определенной группы насекомых?
Американские биоинженеры Гарвардского и Корнелльского университетов и компаний Monsanto опубликовали в журнале Nature статью, в которой описывают новый хитроумный метод, который позволяет при помощи искусственной эволюции быстро, чтобы получить новые модификации Bt-токсинов, с свойства, нужные.
На поверхности клеток кишечника насекомых есть большое количество потенциальных целей для Bt-токсинов (различных белковых рецепторов), но не все они используются существующие в природе Bt-токсинов. Таким образом, вы можете попытаться изменить ту часть последовательности аминокислот токсина, которая служит для распознавания рецептора-мишени, так, чтобы токсин начал общаться с какой-то другой приемник. В остальном, токсин может оставить без изменений. В результате получается, что мы, может быть, мы получим новый токсин, который будет столь же эффективным, разрушить мембраны клеток кишечника, но и прикрепить к нему будет другим белкам поверхности этих клеток. Известно, что устойчивость насекомых к Bt-токсинам, как правило, развивается через мутации, изменяют соответствующие поверхности протеина или не выключения его выражения (без многих рецепторов белка может жить, но с продырявленными клетки эпителия кишечника — это невозможно). Таким образом, изменяя специфичность токсина (заставляя его признать, другой приемник), может преодолеть выработанную насекомых устойчивости.
Но как изменить специфичность токсина? Для этого, необходимо не один и не два, а много замен аминокислот. К сожалению, современные знания о связи последовательности аминокислот белка, его функциональность по-прежнему являются недостаточными, чтобы просто взять и разработать белков на бумаге или на компьютере. Таким образом, наилучшим методом по-прежнему остается «дарвиновская эволюция в пробирке», то есть, мутаций и отбора. Природа тоже не в состоянии придумать ничего. Тот же принцип использует и иммунная система позвоночных для производства специфических антител, избирательно связывающихся с заданным антигеном (см.: Мутагенез в лимфоцитах — результат целенаправленного изменения ДНК и последующей «неточной починки», «Элементы», 03.09.2007).
Для получения новых токсинов, авторы изменили недавно изобретенная технология «непрерывной эволюции с помощью фаг» (фаг-assisted непрерывной эволюции, PACE, см.: Кевин M. Esvelt, Jacob C. Carlson & David R. Liu, 2011. System for the continuous directed evolution of biomolecules). Суть метода ПАЧЕ, что бактерии, вставляют небольшой дополнительной хромосомы (плазмиду, на рис. 1, это обозначено букв AP), содержащий ген вирусного белка pIII (M13 ген III). Этот протеин необходим для распространения вирусов бактериофагов. При этом, регуляторную область гена конструируют таким образом, чтобы ген включается только при наличии в клетке белки, обладающие определенные свойства (Evolving протеин на рис. 1). Затем бактерии заражают бактериофагами (SP), которые не имеют свой собственный ген pIII. В геноме бактериофага, вставленного гена заготовки: ген «эволюционирующего белка», который исследователи хотят изменить, синтетическая эволюции (Эволюция гена). Все, что происходит в проточном водохранилище является постоянным прибытием новых бактерий, которые выпускаются там быстро могут размножиться. Фаги, тем не менее, размножаются быстрее бактерий, таким образом, в системе PACE развиваются только гены вирусные, а не бактериальные, а не плазмидные. Селективное преимущество получают те фаги, которых «эволюционирующий» ген обеспечивает наиболее эффективное производство белка pIII, закодированы на плазмиде AP. Для регулирования скорости мутагенеза в клетках бактериальных добавляет другая плазмида, МП. Она содержит генетическую конструкцию, которая позволяет регулировать скорость мутирования, от концентрации сахара арабинозы в среде.
Основным преимуществом этой технологии является то, что она позволяет проводить искусственную эволюцию в автоматическом режиме в течение многих последовательных поколений. До сих пор разработка новых белков метод искусственной эволюции, как правило, требует вмешательства человека на каждом шагу: сначала нужно умножить исходный ген, что делает мутаций, а затем синтезировать протеины, принимать от них лучше, отсеквенировать гена, еще раз умножить его с мутациями и т. д. Процесс был очень трудоемким, и, следовательно, дело чаще всего ограничивалось лишь несколькими поколениями репликаторы. Однако для серьезных эволюционных изменений необходимо, как правило, много поколений. Ранее можно было частично автоматизировать искусственной эволюции рибозимов (см.: Evolution, под управлением компьютера, «Элементы», 12.04.2008), но эволюция белков эта технология передачи трудно. То, что биологи теперь могут сделать — вирус, быстро эволюционирующие репликаторы в природе, в режиме » off-line «изобрести» человека белки, это, несомненно, впечатляющее достижение.
Тем не менее, система PACE еще не был использован для получения белков, избирательно связывающихся с другими протеинами.
Авторы поставили себе целью получения новой модификации широко используется в генной инженерии Bt-токсин Cry1Ac, что связывает крайней мере, один приемник TnCAD бабочка металловидки серый (Trichoplusia ni, см.: Cabbage петлителя) — опасного вредителя. Природный токсин Cry1Ac, с бактерией Bacillus thuringiensis, не взаимодействует с приемником TnCAD и бабочка T. ni уже удалось разработать сопротивления этот токсин.
Система ПАСЕ был изменен следующим образом (fig. 1). В геноме бактериофага (SP), как «эволюционирующего ген вставлен ген белка, который представляет собой участок токсина Cry1Ac, служащий для распознавания приемника хозяйской клетки, подключен к одной из частей (субъединиц), и бактериальная РНК-полимераза. В плазмиду AP перед геном белка pIII (что, как мы знаем, необходим для размножения вируса) ввел регуляторную зону, содержащую фрагмент ДНК (синий прямоугольник на рисунке. 1, в), признаны специальные ДНК-мосты белка (он изображен в виде четырех синих и голубых кружочков на рисунке. 1, в). В плазмиде также имеет ген, кодирующий ДНК-связывающий белок-станция с «целевой» (target) — фрагмент рецептора TnCAD бабочка-прага. Итак, для начала выражение pIII, белок Cry1Ac, закодированные в геноме фага, должны присоединиться к «цели». Итак, пришитом к нему фрагмент РНК-полимеразы, если объединить все из мульти-материала бактериальной РНК-полимеразы, что будете в нужном месте, чтобы реализовать транскрипции pIII и производить белок, необходимый для размножения вируса. Наконец, смогут распространяться только вирусы, которых Cry1Ac немного прилипает к TnCAD. Чем сильнее он будет получать, тем быстрее будут размножаться вирус.
Тем не менее, приемник TnCAD так мало похож на естественный, мишенью токсина Cry1Ac, что последний к нему не прилипает, так что выбор старта, не за что зацепиться. Попытка использовать сразу TnCAD как цель не удалась: ни один вирус не смог размножиться. Так, авторы изготовили «ступени» посредник » синтетической эволюции: модифицированная версия TnCAD, в котором три аминокислоты были заменены таким образом, ключевым для этапа белков, признан Bt-токсинов, стал больше похож на естественные цели Cry1Ac.
Это помогло, и на 276 часов эволюции (что соответствует то же число поколений бактериофаги, потому, что смена поколений происходит примерно раз в час), удалось вывести несколько вариантов Cry1Ac, доверия прилипающих к модифицированному TnCAD. После того, цель становится нормальной TnCAD, а после более 252 часов были получены параметры Cry1Ac, эффективно общаться с приемником.
Источник Cry1Ac новых различных токсинов 10-12 аминокислотными заменами. Это много: получить такие протеины без помощи ПЕЙС, вручную размножая генов и отбора белков на каждом этапе, будет очень трудно.
Тем не менее, это не было окончательной победой. Полученные белки, связанные с TnCAD, но сохранили ли они свою смертоносность для бабочки-прага? Как оказалось, не. Эксперименты показали, что новые протеины потеряли устойчивость к пищеварительным ферментам гусеницы: они просто распадаются в кишечнике и практически не обладают токсическим действием.
Этот результат был вполне ожидаемым. В конце концов, в ходе искусственной эволюции выбор был только умение Cry1Ac общаться с приемником TnCAD, и все другие свойства протеина проигнорированы. Чтобы еще получить эффективный токсин, авторы взяли, что «отменить» закрепились мутации, и увидеть, как это будет влиять на токсичность. В результате, выяснилось, что на ранних стадиях эволюции, искусственного, когда цель была использована по-прежнему не является реальным TnCAD, а его модифицированная версия, эволюционирующего Cry1Ac были зафиксированы две аминокислотные замены, которые сделали протеин уязвимым для пищеварительных ферментов гусеницы. Когда исследователи взяли хотя такая замена (то есть вернули соответствующих аминокислот в исходное состояние), и был эффективным, токсин, который убивает любого на гусеничном ходу, T. ni: как устойчивы к оригиналу Cry1Ac и нестабильные. Смертоносность нового токсина по отношению к устойчивым бабочек была сопоставима с токсичностью происхождения Cry1Ac по сравнению с кодом «бабочки», еще не выработавшим устойчивость к Cry1Ac. Таким образом, купленный в праге сопротивления удалось успешно преодолеть. Новый токсин убивает только гусениц T. ni и ряда близких видов бабочек, которые имеют аналогичный приемник, но безвреден для других животных.
Исследование показало, что в вечной битве человека с насекомыми для урожая еще есть что-то противостоять быстро эволюционирующим вредителей. Поставив себе на службу еще более быстро эволюционирующие вирусы, человечество сможет, как минимум, на равных участвовать в гонке вооружений эволюционной насекомыми-фитофагами. Вероятно, теперь производство ГМ-растений с новыми инсектицидными белками, можно будет поставить на поток, что позволит существенно увеличить производительность сельского хозяйства в глобальном масштабе. Учитывая, что население Земли уже в середине века достигнет отметки 10 миллиардов долларов, значение новой технологии трудно переоценить.
Источник: Ahmed H. Badran, Victor M. Guzov, Цин-Хуай, Melissa M. Kemp, Prashanth Vishwanath, Венди Kain, Autumn M. Нанс, Artem Evdokimov, Farhad Moshiri, Keith, H. Turner, Пинг-Ван, Томас Malvar & David R. Лю. Continuous evolution of Bacillus thuringiensis токсинов overcomes insect resistance // Nature. 2016. Ст. 533. Стр. 58-63.
См. также:
1) Трансгенный хлопок помог крестьянам китайских победить опасного вредителя, «Элементы», 20.09.2008.
2) Насекомые-вредители защищаются от биологического оружия, «Элементы», 08.10.2007.
3) В. В. Голавль. Растения-ГМО.
4) А. Ю. Панчин. ГМО — мифические опасности.
Александр Марков
